De ce un copil poate avea un test pozitiv și altul negativ și ce înseamnă acest lucru în PANS/PANDAS?
În evaluarea copiilor cu PANS/PANDAS, părinții ajung uneori în fața unui dosar întreg de analize: IgM, IgG, ELISA, IFA, Western Blot, Immunoblot, ELISpot, PCR, FISH, microarray.
Apoi apare inevitabil întrebarea: cum poate aceeași infecție să fie pozitivă la un test și negativă la altul?
Răspunsul este mai simplu decât pare: testele nu caută toate același lucru.
Unele încearcă să găsească direct microorganismul sau componente ale acestuia. Altele caută anticorpii pe care sistemul imun i-a produs după întâlnirea cu microorganismul. Altele analizează răspunsul celulelor T.
Înainte să comparăm două rezultate, trebuie deci să înțelegem ce anume a măsurat fiecare.
Două perspective: căutăm microorganismul sau răspunsul organismului?
Putem împărți, simplificat, investigațiile în metode directe și indirecte.
Metodele directe caută ceva care aparține agentului infecțios: un antigen, ADN, ARN sau microorganismul viabil. În această categorie intră testele antigenice, PCR, FISH și cultura.
Metodele indirecte caută ceea ce a făcut sistemul nostru imun după întâlnirea cu agentul: anticorpi sau răspuns celular. Aici intră ELISA, IFA, Western Blot, Immunoblot, unele tipuri de microarray și ELISpot.
Diferența este fundamentală.
Dacă găsim IgG, am găsit anticorpi.
Dacă găsim prin PCR o secvență genetică specifică, am detectat material genetic al agentului în proba respectivă.
Cele două rezultate nu spun același lucru.
ELISA – există anticorpi împotriva acestui agent?
ELISA este una dintre cele mai cunoscute metode de laborator.
În serologie, proba pacientului este pusă în contact cu antigene ale microorganismului. Dacă există anticorpi care le recunosc, aceștia se leagă de antigene și reacția poate fi măsurată.
Așa apar binecunoscutele rezultate IgM și IgG.
IgM apare frecvent mai devreme în evoluția unei infecții, iar IgG apare de regulă ulterior și poate persista mult timp.
Totuși, formularea „IgM = infecție activă, IgG = infecție veche” este prea simplă. Evoluția anticorpilor diferă în funcție de microorganism și de pacient, iar rezultatul trebuie interpretat împreună cu momentul recoltării și tabloul clinic.
ELISA poate fi folosit și pentru detectarea antigenelor, nu doar a anticorpilor.
IFA – anticorpi evidențiați prin fluorescență
IFA, sau imunofluorescența indirectă, este tot o metodă serologică.
Anticorpii pacientului sunt puși în contact cu antigenele, iar legarea lor este evidențiată fluorescent.
De aici provin rezultate pe care părinții le pot întâlni sub forma:
1:64, 1:128, 1:256 etc.
Acestea reprezintă titruri de anticorpi.
Un titru mai mare nu trebuie însă interpretat ca și cum am fi măsurat direct „cantitatea de bacterie” din organism. Măsurăm răspunsul imun detectabil prin metoda respectivă.
Western Blot – față de ce proteine există anticorpi?
Western Blot oferă informații mai detaliate despre anticorpi.
Proteinele sunt separate, iar laboratorul verifică dacă anticorpii pacientului recunosc anumite proteine.
Așa apar benzile întâlnite pe unele rezultate.
În loc să știm doar că există o reacție față de microorganism, putem vedea că sistemul imun recunoaște anumite componente ale acestuia.
Dar mai multe benzi nu înseamnă automat „infecție mai puternică”, iar criteriile pentru un rezultat pozitiv diferă în funcție de test.
Immunoblot – aceeași idee, cu antigene selectate
Immunoblotul modern utilizează frecvent antigene atent selectate, inclusiv proteine recombinante sau peptide.
Scopul este același: să vedem față de ce antigene există anticorpi.
Poate oferi astfel o imagine mai detaliată a răspunsului imun decât un rezultat global de anticorpi.
Dar Immunoblotul rămâne, în această utilizare, un test indirect.
Un IgG pozitiv demonstrează existența anticorpilor detectabili față de antigenele respective. Nu demonstrează singur că microorganismul este viu sau că se multiplică în acel moment.
Microarray – sute de întrebări pe aceeași suprafață
Aici apare una dintre tehnologiile moderne foarte interesante: microarray-ul.
Imaginați-vă o plăcuță microscopică pe care sunt așezate, în puncte foarte mici, numeroase antigene diferite.
În loc să întrebăm:
„Există anticorpi împotriva antigenului A?”
putem întreba simultan:
„Există anticorpi împotriva A, B, C, D… și a multor alte antigene?”
Pe aceeași suprafață pot fi analizate simultan numeroase proteine sau peptide.
Dacă anticorpii pacientului recunosc anumite antigene de pe cip, apare un semnal care poate fi măsurat.
Protein microarray
Pe cip sunt amplasate proteine sau antigene proteice.
Astfel poate fi analizat simultan răspunsul anticorpilor față de numeroase proteine ale unuia sau mai multor microorganisme.
Această tehnologie permite investigarea unui profil mult mai larg al răspunsului imun decât analiza unui singur antigen. Protein microarrays sunt folosite în cercetarea bolilor infecțioase tocmai pentru posibilitatea de a examina multe răspunsuri antigen–anticorp în paralel.
Peptide microarray
În locul proteinelor întregi pot fi utilizate fragmente mici de proteine – peptide.
Acest lucru permite o analiză și mai fină:
nu doar „există anticorpi împotriva proteinei X?”, ci și „ce porțiune a proteinei X este recunoscută de anticorpi?”
De ce este microarray-ul interesant?
Principalul avantaj este multiplexarea: o cantitate relativ mică de probă poate fi analizată simultan împotriva unui număr foarte mare de antigene. În literatura de specialitate, microarray-urile proteice sunt utilizate tocmai pentru caracterizarea amplă a răspunsului umoral la agenți infecțioși.
Dar există o precizare esențială:
Microarray nu înseamnă automat PCR.
Dacă vorbim despre un protein/peptide microarray serologic, ceea ce detectăm este în principal reactivitatea anticorpilor față de antigenele aflate pe cip.
Prin urmare, un rezultat pozitiv arată că anticorpii pacientului recunosc ținta respectivă.
Nu demonstrează automat prezența actuală a microorganismului.
Mai multe antigene testate nu înseamnă nici că orice reactivitate are automat semnificație clinică. Specificitatea antigenelor, reacțiile încrucișate, pragurile de pozitivitate și validarea platformei rămân esențiale.
ELISpot – nu mai căutăm anticorpii, ci răspunsul celulelor T
ELISpot investighează un compartiment diferit al imunității.
Celulele pacientului sunt expuse unor antigene. Dacă există limfocite T care reacționează la acestea, celulele pot secreta anumite molecule – frecvent citokine precum interferon gamma.
Reacțiile apar sub forma unor mici „spots”, care sunt numărate.
Simplificat:
ELISA / Western Blot / Immunoblot / microarray serologic → caută răspunsul anticorpilor.
ELISpot → caută răspunsul celular.
De aceea este biologic posibil ca anticorpii și ELISpot să nu ofere rezultate identice.
Un ELISpot pozitiv nu demonstrează însă, singur, existența unui microorganism viu. Arată existența unui răspuns celular detectabil față de antigenele testate.
PCR – găsim materialul genetic?
Cu PCR trecem de la răspunsul imun la căutarea directă a agentului.
PCR caută și amplifică secvențe genetice specifice.
În funcție de microorganism și tehnologie, sunt investigate ADN-ul sau ARN-ul. Există PCR convențional, real-time PCR, qPCR, RT-PCR și sisteme multiplex.
Dacă secvența căutată este prezentă în probă într-o cantitate suficientă, poate fi detectată.
Dar aici există un aspect foarte important:
PCR analizează proba, nu întregul organism.
Dacă recoltăm sânge, analizăm ceea ce există în sângele respectiv.
Dacă microorganismul se găsește predominant într-un țesut, este prezent în cantitate foarte mică sau apare intermitent în sânge, este posibil ca proba recoltată să nu conțină suficient material genetic pentru detectare.
De aceea, un PCR negativ înseamnă riguros:
„Ținta genetică nu a fost detectată în această probă peste limita de detecție a metodei.”
Nu înseamnă automat că microorganismul nu poate exista nicăieri în organism.
Dar nici nu trebuie făcut raționamentul invers: un PCR negativ nu este o dovadă că există o infecție „ascunsă”.
FISH – căutarea unei ținte cu ajutorul fluorescenței
FISH înseamnă Fluorescence In Situ Hybridization.
Sunt utilizate sonde fluorescente proiectate pentru a se lega de anumite secvențe de ADN sau ARN.
Dacă ținta există în probă, sonda se poate lega de aceasta și poate fi vizualizată fluorescent.
Este deci o metodă directă, foarte diferită de măsurarea anticorpilor.
Dar, asemenea PCR, depinde de existența unei cantități detectabile din ținta respectivă în proba recoltată.
Cultura – există un microorganism viu?
Cultura încearcă să răspundă unei întrebări foarte concrete:
Putem face microorganismul să crească?
Proba este introdusă într-un mediu potrivit. Dacă microorganismul este prezent și se poate multiplica în condițiile respective, poate fi identificat.
Pentru multe bacterii se poate realiza ulterior și antibiograma.
Problema este că nu toate microorganismele cresc ușor. Unele necesită condiții speciale, altele cresc foarte lent, iar pentru unele cultura nu este o metodă practică de rutină.
Testele antigenice – găsim o componentă a agentului?
Testele antigenice caută direct anumite componente ale microorganismului.
Un exemplu familiar părinților este testul rapid pentru streptococ.
Aici nu măsurăm anticorpii produși de copil. Încercăm să găsim antigen bacterian în proba recoltată.
Sensibilitatea nu este însă perfectă, motiv pentru care un test rapid negativ poate necesita, în anumite circumstanțe, confirmare prin cultură sau altă metodă. Recomandările de evaluare PANS/PANDAS discută tocmai această diferență între documentarea directă a infecției streptococice și răspunsul serologic ulterior.
NGS – când nu mai căutăm neapărat un singur agent
Next Generation Sequencing – NGS reprezintă o altă familie de tehnologii.
PCR-ul țintit pornește de obicei de la întrebarea:
„Există agentul X?”
Prin secvențiere, și în special prin metagenomic NGS (mNGS), poate fi analizat un spectru mult mai larg de material genetic dintr-o probă.
Este o abordare foarte interesantă pentru anumite cazuri complexe, dar nu este un detector universal de infecții. Tipul probei, contaminarea, cantitatea de material genetic și interpretarea semnificației secvențelor identificate rămân foarte importante.
De ce ies atunci testele diferit?
Pentru că ele privesc aceeași problemă din unghiuri diferite.
IgG pozitiv + PCR negativ?
Este posibil. Primul a găsit anticorpi, al doilea nu a detectat material genetic în proba analizată.
ELISA negativ + Immunoblot sau microarray pozitiv?
Este posibil. Platformele pot utiliza antigene diferite, pot analiza mai multe ținte și pot avea praguri și caracteristici de performanță diferite.
Anticorpi negativi + ELISpot pozitiv?
Este posibil. Un test examinează răspunsul umoral, celălalt răspunsul celular.
Microarray pozitiv pentru mai multe antigene?
Înseamnă că a fost detectată reactivitate față de acele ținte conform criteriilor platformei. Nu trebuie tradus automat prin „am toate aceste infecții active”.
Aceasta este probabil una dintre cele mai importante distincții pentru părinți.
Ce legătură au toate acestea cu PANS/PANDAS?
În PANDAS, asocierea temporală cu infecția cu streptococ de grup A este parte a conceptului diagnostic. PANS are criterii mai largi și nu presupune obligatoriu existența unei infecții; diagnosticul este clinic și presupune și excluderea altor explicații pentru tabloul copilului. Nu există în prezent un biomarker circulant unic, patognomonic, care să diagnosticheze PANS sau PANDAS.
Analizele pot însă ajuta la reconstruirea contextului în care au apărut simptomele.
Un exemplu foarte bun este streptococul.
Un test rapid, o cultură sau o metodă moleculară încearcă să documenteze agentul la locul și momentul recoltării.
ASLO și anti-DNase B, în schimb, măsoară răspunsul imun față de o infecție streptococică și trebuie interpretate în raport cu momentul bolii. Evaluarea PANDAS se bazează tocmai pe încercarea de a documenta relația temporală dintre infecția GAS și debutul sau exacerbarea neuropsihiatrică.
De aceea, într-un copil evaluat pentru PANS/PANDAS, cronologia poate fi la fel de importantă ca analiza: când a început infecția, când au apărut simptomele neuropsihiatrice și când a fost recoltat fiecare test.
Nu întrebați doar „Este pozitiv?”
Atunci când primiți un rezultat, întrebarea cea mai utilă nu este:
„Este pozitiv sau negativ?”
Ci:
„Ce anume a măsurat acest test?”
Anticorpi? Răspunsul limfocitelor T? Un antigen? ADN? ARN? Un microorganism capabil să crească?
Apoi trebuie să știm din ce probă a fost făcut testul, când a fost recoltată și care sunt limitele metodei respective.
ELISA, Western Blot, Immunoblot, microarray, ELISpot, PCR și FISH nu sunt variante mai sofisticate sau mai puțin sofisticate ale aceluiași test. Ele privesc părți diferite ale aceleiași povești biologice.
Uneori vedem urma lăsată în sistemul imun de întâlnirea cu microorganismul. Alteori vedem răspunsul celulelor T. Alteori găsim chiar materialul genetic al agentului.
Iar în PANS/PANDAS, unde încercăm adesea să reconstruim retrospectiv ce s-a întâmplat în jurul unui debut neuropsihiatric brusc, această diferență devine cu atât mai importantă.
Nu este suficient să știm că un test este pozitiv. Trebuie să știm ce a devenit pozitiv și ce poate – și ce nu poate – demonstra acel rezultat.
Ce este Comunitatea Sindrom PANDAS/PANS România?
Sindrom PANDAS / PANS România este o inițiativă de informare și advocacy, construită în jurul unei comunități active de părinți, dedicată creșterii nivelului de conștientizare asupra sindromului PANDAS, a spectrului PANS și a afecțiunilor neuroimune pediatrice în România.
Pagina oferă acces la informații actualizate despre mecanismele de neuroimunologie implicate, precum și despre afecțiuni conexe autoimune și post-infecțioase, care pot sta la baza unor debuturi bruște de simptome neuropsihiatrice la copii, frecvent confundate cu ADHD, autism sau tulburări psihiatrice clasice.
Direcțiile principale sunt:
- Informarea corectă, bazată pe date științifice și experiențe reale;
- Educația publicului și a profesioniștilor din sănătate;
- Advocacy, pentru recunoașterea oficială a PANS/PANDAS și a patologiilor neuroimune asociate în România, dezvoltarea unor cadre de diagnostic și tratament și alinierea la practicile medicale internaționale.
Inițiativa își propune să aducă în prim-plan o perspectivă integrată asupra acestor tulburări, reducând decalajul dintre realitatea clinică și nivelul actual de recunoaștere instituțională.
Disclaimer
Informațiile prezentate în acest articol sunt destinate exclusiv scopurilor educative și informative. Acestea nu constituie un diagnostic medical, un tratament sau o recomandare terapeutică personalizată. Consultați întotdeauna un medic sau un specialist calificat înainte de a începe orice formă de tratament, dietă, supliment sau modificare a stilului de viață. Fiecare persoană este diferită, iar abordările care funcționează pentru un individ pot să nu fie potrivite pentru altul. Evaluarea și supravegherea profesională sunt esențiale.
Bibliografie
- Chang K, Frankovich J, Cooperstock M, et al. Clinical Evaluation of Youth with Pediatric Acute-Onset Neuropsychiatric Syndrome (PANS): Recommendations from the 2013 PANS Consensus Conference. Journal of Child and Adolescent Psychopharmacology. 2015;25(1):3–13. doi:10.1089/cap.2014.0084.
- Swedo SE, Seidlitz J, Kovacevic M, et al. Clinical Presentation of Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal Infections in Research and Community Settings. Journal of Child and Adolescent Psychopharmacology. 2015;25(1):26–30. doi:10.1089/cap.2014.0073.
- Frankovich J, Thienemann M, Pearlstein J, Crable A, Brown K, Chang K. Multidisciplinary Clinic Dedicated to Treating Youth with Pediatric Acute-Onset Neuropsychiatric Syndrome: Presenting Characteristics of the First 47 Consecutive Patients. Journal of Child and Adolescent Psychopharmacology. 2015;25(1):38–47. doi:10.1089/cap.2014.0081.
- PANS Collaborative Consortium. Special Issue on Pediatric Acute-Onset Neuropsychiatric Syndrome. Journal of Child and Adolescent Psychopharmacology. 2015;25(1).
- Natesan M, Ulrich RG. Protein Microarrays and Biomarkers of Infectious Disease. International Journal of Molecular Sciences. 2010;11(12):5165–5183. doi:10.3390/ijms11125165.
- Vigil A, Davies DH, Felgner PL. Defining the Humoral Immune Response to Infectious Agents Using High-Density Protein Microarrays. Future Microbiology. 2010;5(2):241–251. doi:10.2217/fmb.09.127.
- Bacarese-Hamilton T, Ardizzoni A, Gray J, Crisanti A. Protein Arrays for Serodiagnosis of Disease. Methods in Molecular Biology. 2004;264:271–283. doi:10.1385/1-59259-759-9:271.
- Engvall E, Perlmann P. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Quantitative Assay of Immunoglobulin G. 1971;8(9):871–874.
- Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1979;76(9):4350–4354. doi:10.1073/pnas.76.9.4350.
- Czerkinsky CC, Nilsson LÅ, Nygren H, Ouchterlony Ö, Tarkowski A. A Solid-Phase Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) Assay for Enumeration of Specific Antibody-Secreting Cells. Journal of Immunological Methods. 1983;65(1–2):109–121.
- Mullis KB, Faloona FA. Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction. Methods in Enzymology. 1987;155:335–350.
- Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, et al. The Real-Time Polymerase Chain Reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006;27(2–3):95–125. doi:10.1016/j.mam.2005.12.007.
- Levsky JM, Singer RH. Fluorescence In Situ Hybridization: Past, Present and Future. Journal of Cell Science. 2003;116(Pt 14):2833–2838. doi:10.1242/jcs.00633.
- Chiu CY, Miller SA. Clinical Metagenomics. Nature Reviews Genetics. 2019;20:341–355. doi:10.1038/s41576-019-0113-7.
- Wilson MR, Sample HA, Zorn KC, et al. Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. New England Journal of Medicine. 2019;380:2327–2340. doi:10.1056/NEJMoa1803396.
- Shulman ST, Bisno AL, Clegg HW, et al. Clinical Practice Guideline for the Diagnosis and Management of Group A Streptococcal Pharyngitis. Clinical Infectious Diseases. 2012;55(10):e86–e102. doi:10.1093/cid/cis629.
- Stanford Medicine. Pediatric Acute-Onset Neuropsychiatric Syndrome (PANS): Diagnosis and Treatment Recommendations. Stanford PANS Program.
- PANDAS Physicians Network. PANS/PANDAS Diagnostic and Treatment Guidelines.
